編譯：微科盟coco，編輯：微科盟Tracy、江舜堯。
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導讀
“鳳丹”牡丹因其觀賞、藥用和食用特性而在中國廣泛種植。牡丹全株富含生物活性物質，但人們對葉片代謝物的全面了解有限。本研究采用基於UPLC-ESI-TOF-MS的非靶向代謝組學策略來分析“鳳丹”牡丹葉片發育過程中生物活性代謝物的動態變化。基於GNPS平臺、內部數據庫和文獻，我們總共對321種代謝物進行了快速註釋。為了準確定量選定的代謝物，我們使用了HPLC-ESI-MS/MS的靶向方法。芍藥內酯苷、芍藥苷、五沒食子酰葡萄糖、木犀草素7-葡萄糖苷和苯甲酰芍藥苷被認為是主要的生物活性化合物，在葉片發育過程中含量變化顯著。“鳳丹”牡丹葉子發育過程中的代謝變化很大程度上歸因於抗氧化活性的變化。在所有測試的細菌中，葉提取物對乙型溶血性鏈球菌表現出優異的抑制作用。本研究首先為牡丹葉子的發育過程提供了新的見解。S1-S2階段可能是最有希望用於食品或制藥用途的收獲時間。
論文ID
原名：Integrated Metabolomics Approach Reveals the Dynamic Variations of Metabolites and Bioactivities in Paeonia ostii ‘Feng Dan’ Leaves during Development
譯名：綜合代謝組學方法揭示“鳳丹”牡丹葉發育過程中代謝物和生物活性的動態變化
期刊：International Journal of Molecular Sciences
IF：5.6
發表時間：2024.01
通訊作者：張延龍，鄧露
通訊作者單位：西北農林科技大學
實驗設計
實驗結果
1. 牡丹葉富含酚類和黃酮類化合物
植物次生代謝產物在應對生物和非生物脅迫中發揮著至關重要的作用。在這些代謝物中，多酚廣泛分佈於整個植物界，對人類健康具有多種有益作用。為了研究牡丹葉片在生長發育過程中多酚含量的變化，我們對總酚含量（TPC）和總黃酮含量（TFC）進行了研究。葉片的發育時期，從葉片展開到衰老，分為十七個階段（S1-S17）。如圖1所示，“鳳丹”牡丹的TPC先下降，然後上升，最終穩定。S11階段的TPC最高值為10.21 g GE/100 g DW，而S3階段的最低值為7.09 g GE/100 g DW。在穩定期間，TPC保持在9 g GE/100 g DW左右。相比之下，“鳳丹”牡丹的TFC變化則呈現出相反的趨勢。我們在S3階段觀察到最高的TFC值，占1.01 g RE/100 g DW，而最低值在S8階段為0.25 g RE/100 g DW。初始值和最終值分別為0.45 g RE/100 g DW (S1)和0.52 g RE/100 g DW (S17)。
圖1 “鳳丹”牡丹葉片中TPCs (a)和TFCs (b)在整個發育階段的動態變化。TPC，總酚含量。TFC，總黃酮含量。
圖8 “鳳丹”牡丹葉在所有發育階段的表型。
植物次生代謝物的積累可能受到許多因素的影響，包括溫度、光照、土壤性質、水和化學脅迫。我們觀察到牡丹葉片（Tree peony leaves，TPL）的TPC和TFC在S8階段突然下降，這可能是因為光照。由於5月份降水較多，連續陰雨天主要分佈在S7和S8之間（圖S1）。陽光，尤其是UV-B，是影響多酚生物合成的重要因素之一。光照不足導致S8時TPL中的TPC和TFC突然下降。次生代謝物的積累也可能受到發育的影響。值得註意的是，牡丹葉片的TPC和TFC變異在S3階段都表現出明顯的轉折點，這恰好是牡丹從營養生長向生殖生長的轉變（表S1，圖S1），表明這種轉變可能是TPL發育過程中影響TPCs和TFCs的關鍵因素。考慮到環境因素和發育的影響，我們在下一個生長季節仍需要對TPL發育過程中的變化進行調查。
盡管牡丹葉的各個發育階段的TPC有所不同，但牡丹葉的TPC在大多數階段均顯著高於牡丹的其他部分，如根、莖、花和種子。這表明，在所有牡丹組織中，葉子的多酚濃度最高。因此，牡丹葉可以作為多酚的重要天然來源，具有巨大的開發潛力。
2. 通過非靶向代謝組方法註釋代謝物
為了全面研究發育過程中TPL的代謝組成和變化，我們采用了基於LC-QTOF-MS的非靶向代謝組策略，這種方法具有高通量和高分辨率的優點。所有階段的TPL數據均使用數據相關采集 (DDA) 模式獲取。該矩陣中TPL代謝物的註釋是基於全球天然產物社交分子網絡 (GNPS) 平臺、內部MS數據庫和已發表的文獻進行的。最終，共有321種化合物被註釋，其中大多數被歸類為類黃酮、多酚和萜類化合物（表 S2）。
3. 非靶向代謝組數據的多變量統計分析
我們使用MZmine 2軟件處理每個樣本的原始數據。經過峰檢測、同位素峰分組和峰對齊後，我們獲得大小為1353 × 54的數據矩陣（由17個階段和一個TPL質量控制組成，重復三次）。為了分析TPL代謝物的變異模式，我們將矩陣導入SIMCA 14.1軟件中，建立主成分分析（PCA）模型。如圖 2a 所示，生物三次重復中的所有質量控制 (QC)成功聚集在一起，證實了非靶向代謝組方法的良好重復性。第一主成分和第二主成分之和占總方差的57.3%，捕獲了大部分變量信息。PCA的散點圖說明了從S1到S7（組 1）的周期和從 S8 到 S17（組 2）的周期之間的明顯分離。此外，層次聚類分析(HCA)也顯示出兩組的明顯分離（圖 2b）。這一發現與TPC和TFC的結果一致，表明組1和組2之間的含量存在顯著差異。這種現象可能主要受牡丹從營養生長向生殖生長轉變的影響。
圖2 “鳳丹”牡丹葉片不同時期的多元統計分析。(a)PCA得分散點圖；(b)PCA的HCA圖；(c)OPLS-DA得分散點圖；(d)OPLS-DA的S圖。紅點，VIP > 1；綠點，VIP < 1。
此外，我們使用偏最小二乘判別分析（OPLS-DA）為兩組構建模型。我們進行了隨機排列檢驗，發現R2和Q2值分別為99.72%和78.98%，表明了OPLS-DA模型的高質量和可靠性。此外，OPLS-DA模型的得分圖（圖 2c）清楚地顯示了兩組中個體的分離，這可歸因於差異代謝物的存在。S圖直觀地表示VIP值大於1的差異代謝物（以紅色標記）（圖 2d）。通過應用倍數變化閾值（FC ≥ 2 或 FC ≤ 0.5），我們在第1組和第2組之間總共觀察到602種差異化合物。其中，隻有117種化合物是已知代謝物（圖 3）。聚類熱圖分析顯示，葉子的前7個階段聚集在一起，而後10個階段分別聚類，表明這些已知的代謝物是區分第1組和第2組的重要標記。值得註意的是，TPL的早期階段表現出較高的芍藥內酯苷含量、氧化芍藥苷、芍藥苷、蘆丁和四沒食子酰葡萄糖，而TPL後期的積雪草酸、橄欖脂素-4'-O-葡萄糖苷和紅景天苷含量較高（圖3）。
圖3 “鳳丹”牡丹葉不同時期117種重要差異代謝物的熱圖。
在TPL的開發過程中，差異代謝物存在顯著變化。為了確定與第1組和第2組差異代謝物相關的代謝途徑，我們進行了KEGG富集分析（圖 4）。該分析表明，這些差異代謝物主要富集於17條代謝途徑。特別重要的是黃酮、黃酮醇和苯丙素生物合成所涉及的途徑，因為它們含有大量差異代謝物。此外，單萜生物合成成為了一個值得註意的途徑，我們在差異代謝物中鑒定出幾種單萜類化合物，包括芍藥苷、芍藥內酯苷和氧化芍藥苷。這些單萜糖苷是芍藥科的特征代謝物，盡管其生物合成途徑仍不清楚。雖然圖4無法完全說明這些單萜糖苷生物合成的具體途徑，但在開發過程中，在TPL中觀察到的高含量和顯著的變化可以作為解開TPL系統中單萜糖苷生物合成途徑的潛在線索。
圖4 “鳳丹”牡丹葉第1組和第2組差異代謝物KEGG富集散點圖。
4. 通過靶向LC-QQQ-MS分析對代謝物進行定量
基於LC-三重-TOF-MS的全掃描MS方法具有高分辨率的優勢，有利於代謝物鑒定。然而，檢測器很容易飽和，從而限制其線性范圍並阻礙代謝物的準確定量。為了解決這一限制，我們利用LC-QQQ-MS進行了靶向性分析，以精確監測TPL發育過程中所選化合物的變化。我們使用先前建立的MRM方法對總共22種化合物進行動態定量，包括13種黃酮類化合物、1種單寧、4種萜類化合物和4種其他酚類化合物。
為了評估TPL整個發育過程中選定代謝物的精確組成，生成了顯示目標代謝物的熱圖。如圖5a所示，代謝物芍藥內酯苷、芍藥苷、五沒食子酰葡萄糖 (PGG)、木犀草素7-葡萄糖苷和苯甲酰芍藥苷被發現是TPL的主要成分。我們在 S4、S4、S1、S3 和 S1 階段觀察到這些化合物的最高濃度，分別為2669.33 mg/100 g DW、1359.17 mg/100 g DW、590.34 mg/100 g DW、451.05 mg/100 g DW和108.20 mg/100 g DW分別（表 S3）。
圖5 牡丹“鳳丹”葉中不同階段目標代謝物的熱圖。(a)用所有目標代謝物繪制；(b)將每個目標代謝物獨立地繪制在一行中。
雖然圖5a提供了TPL中主要代謝物的可視化，但它無法說明每個目標代謝物在不同開發階段的變化。因此，我們繪制了另一張熱圖，其中每個目標代謝物獨立地連續繪制（圖 5b）。顯然，大多數代謝物的含量最高出現在初始階段，然後在S3階段逐漸或快速下降。另一方面，某些代謝物（例如沒食子酸甲酯和金絲桃苷）的含量在TPL發育的最後階段有所增加。這些觀察結果部分解釋了TPL在不同階段的分離，如圖2所示。
總體而言，“鳳丹”葉中的主要化合物為芍藥內酯苷、芍藥苷、PGG、木犀草素7-葡萄糖苷和苯甲酰芍藥苷，含量最高超過100 mg/100 g DW。這些代謝物在TPL的發育過程中表現出顯著的波動，轉折點出現在S4階段左右，即牡丹花期。然而，開花後，這些化合物的水平下降至穩定趨勢。這可以用牡丹的發育，特別是從營養生長到生殖生長的轉變來解釋。芍藥內酯苷、芍藥苷和苯甲酰芍藥苷是芍藥科的特征性代謝產物，具有多種生物活性，包括抗腫瘤、神經保護、抗抑鬱樣和抗菌作用。芍藥苷是牡丹中最典型的單萜類化合物。盡管在已發表的文獻中，研究者們也觀察到了芍藥苷在發育過程中的類似變化趨勢，但下降的程度差異很大。原因可能是樹齡、環境因素等。PGG還表現出多種促進健康的特性，包括抗氧化、抗癌、抗病毒、抗炎和抗糖尿病活性。因此，這些生物活性化合物在TPL中具有巨大的開發利用潛力。我們關於這些化合物動態變化的研究結果為確定最佳收獲時間提供了寶貴的指導。
5. TPLs在不同階段的抗氧化活性
盡管已經研究了“鳳丹”芽期葉片的抗氧化活性，包括2,2-聯氮雙(3-乙基苯並噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽（ABTS •）、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基（DPPH•）、鐵還原抗氧化能力（FRAP）和氧自由基吸收能力（ORAC），但人們對它們在葉片發育過程中的動態變化模式仍不清楚。一般來說，生物活性成分有助於 TPL 的生物活性。TPL的抗氧化活性由於發育過程中代謝物的變化而動態變化。為了監測這些變化，我們進行了ABTS •、DPPH•、FRAP和ORAC測定。結果表明，TPL在S1時的ABTS •、DPPH•、FRAP和ORAC活性與之前的報道基本一致。ABTS •-清除能力、DPPH•-清除能力和FRAP也有類似的趨勢，先是下降，然後在某些階段增加到相對穩定的狀態，最後出現小幅下降（圖6）。ABTS •-清除能力和FRAP的最高和最低活性發生在同一階段。在S1階段，我們觀察到最強的活性，ABTS •-清除能力為32.90 g TE（trolox當量）/100 g DW（凈重），FRAP為27.00 g TE/100 g DW。另一方面，在S4階段，我們觀察到最弱的活性，ABTS •-清除能力為17.53g TE/100g DW，FRAP為11.54g TE/100g DW。TPL的DPPH•清除能力在S13和S4階段達到最高和最低值，分別為49.34 g TE/100 g DW和24.85 g TE/100 g DW。TPL 最強的ORAC活性出現在S1階段，值為21.71 TE/100 g DW，而最弱的ORAC活性出現在最後階段（6.64 g TE/100 g DW）。
圖6 “鳳丹”葉在不同時期的體外抗氧化活性。點和誤差條代表平均值和標準差 (n = 3)。
TPL提取物的抗氧化活性歸因於生物活性化合物的存在。Pearson相關分析揭示了TPL對 ABTS •和DPPH•自由基的清除活性與TPC之間存在密切關系（圖 7，表 S4）。這一發現強調了多酚在清除ABTS •和DPPH•自由基方面的重要作用，這與之前的研究一致。盡管我們觀察到活性（FRAP和ORAC）與總成分（TPC、TFC和TMC）之間的相關性較弱，但特定生物活性代謝物顯示出與FRAP和ORAC活性更強的相關性。值得註意的是，TPL中含量較高的苯甲酸、沒食子酸、苯甲酰芍藥苷、氧化芍藥苷和PGG表現出密切的相關性 (r > 0.4)，並且可能是促成FRAP的主要生物活性化合物（圖7，表S3 和 S4)。我們的分析揭示了ORAC和生物活性成分之間高度復雜的網絡。苯甲酸、槲皮素、( )-兒茶素、異鼠李素、山奈酚和黃芪甲苷的相關系數高於0.5，盡管隻有苯甲酸的含量相對豐富（圖7，表S3和S4）。因此，TPL的ORAC可能受到這些相關代謝物相互作用的影響。
圖7 抗氧化活性和生物活性成分之間的相關網絡。TMC，目標代謝物的總代謝物含量。
6. TPLs在不同階段的抗菌活性
為了研究抗菌潛力，我們使用最小抑菌濃度 (MIC) 方法評估了17個不同階段的TPL提取物。MIC值越低，表明對細菌生長的抑制作用越強。結果表明，所有TPL提取物對受試細菌均表現出顯著的抑制作用，MIC值低於12.61 mg/mL（表1）。在TPL的整個發育階段，我們觀察到其對金黃色葡萄球菌和單核細胞增生李斯特菌表現出了最廣泛的抑制作用，范圍為3.13至12.61 mg/mL，其次是普通變形桿菌和鼠傷寒沙門氏菌，MIC值范圍為3.13 至6.31 mg/mL；大腸桿菌的MIC范圍為0.39至3.13 mg/mL，而溶血鏈球菌-β的MIC范圍為0.2 至 0.39 mg/mL。這些發現表明，不同的發育階段對TPL抑制金黃色葡萄球菌和單核細胞增生李斯特菌生長的能力有顯著影響。此外，TPL 對乙型溶血性鏈球菌和大腸桿菌表現出特別強的抗菌特性，MIC值始終低於3.13 mg/mL，這凸顯了與其他菌株相比，它對這些菌株的有效性。
表1 不同時期牡丹“鳳丹”葉的MIC (mg/mL)
由於MIC值最低，在TPL的早期階段可以發現針對每種細菌的最強活性，這與早期報告一致。隨著葉片的生長發育，其對大多數細菌的抗菌能力都有一定程度的下降，最終在最後階段達到相對穩定的MIC。我們觀察到抗菌趨勢與TPC的變化一致。越來越多的研究證明了多酚化合物作為天然抗菌劑的有效性，這表明TPL的多酚可能在抑制細菌生長方面發揮著關鍵作用。考慮到含量和相關系數，TPL對大腸桿菌的抗菌活性可能主要歸因於苯甲酸、氧化芍藥苷、木犀草素7-葡萄糖苷、PGG和沒食子酸的存在（圖7，表S3和S4）。在單核細胞增生李斯特氏菌測定方面，我們發現抗菌黃酮類化合物，如槲皮素、( )-兒茶素、山奈酚、異鼠李素和黃芪甲苷，與TPL的抑制活性有關（圖 7，表 S3 和 S4）。盡管其他抗菌檢測與單個化合物之間的相關系數小於0.4，但TPL提取物表現出很強的抑制活性（圖7，表S4）。這可能表明存在另一種未定量的有效抑制化合物。通過Pearson相關分析，我們還觀察到一些物種特異性單萜苷（例如苯甲酰芍藥苷和芍藥苷）與單增李斯特菌和大腸桿菌檢測之間存在密切關系，盡管它們的抗菌活性很少被報道。這些化合物的潛在抗菌機制值得在未來的研究中進一步研究。
結論
在本研究中，我們使用綜合代謝組學方法系統地研究了不同發育階段“鳳丹”牡丹葉子中存在的植物化學物質。基於公共或內部MS數據庫，我們對總共321種代謝物進行了全面註釋，其中許多代謝物以前從未在牡丹葉中報告過。牡丹由營養生長向生殖生長的轉變可能是導致代謝物變異趨勢的轉折點。我們在整個葉子發育過程中觀察到代謝物的顯著變化，特別是主要化合物，如芍藥內酯苷、芍藥苷、五沒食子酰葡萄糖、木犀草素7-葡萄糖苷和苯甲酰芍藥苷，這些變化可歸因於抗氧化和抗菌活性的變化。在所有測試的細菌中，TPL提取物對乙型溶血性鏈球菌表現出最強的抑制潛力。這些發現表明，考慮到植物化學物質和生物活性，S1-S2階段可能是最有潛力的收獲時間。本研究為“鳳丹”葉的功能性茶葉或藥用綜合開發利用提供了理論依據。然而，考慮到環境因素的影響，下一個生長季節代謝物的變化模式仍需研究。